Счётчик соматических клеток «ЭКСПЕРТ ССК»

Работа анализатора «Эксперт ССК» основана на методе флуоресцентной микроскопии.

Данный анализатор позволяет:

• сосчитать количество соматических клеток и дифференцировать их: по размеру*, по типу, что в свою очередь позволяет отделять субклинический мастит от дрожжевого и в последствии избавить животное от излишнего медикаментозного лечения антибиотиками. Такой подход положительно скажется на сортности молока, а значит и его цене (в нём будет меньше антибиотиков, или не будет вовсе)
• вести научную работу
• настраивать программное обеспечение на выявление сортового/не сортового молока, превышение уровня соматических клеток по индивидуальным параметрам
• осуществлять визуальный контроль по полученным снимкам на экране анализатора
• определять разновидность бактерий: стрептококки, диплококки, стафилококки и т.д.

*дифференциация клеток по размеру является одним из важных факторов: для маститных клеток, вызванных клинической стадией мастита определён размер 4...20 мКм. Всё что ниже — скорее всего клетки эпителия. Всё что выше – мусор, сгустки либо образования дрожжевого мастита. Таким образом устанавливая размер, мы можем считать только те клетки, которые нас интересуют. А анализатор увидит все – от самых мелких до самых крупных.

Для того чтобы подсчитать соматические клетки на приборе «Эксперт ССК», пробу молока смешивают с краской SOFIA GREEN в специальных кассетах. Необходимо только 8 мкл подготовленного образца для заполнения его пипеткой в одноразовую кассету. Затем кассету загружают в устройство.

Продолжительность анализа составляет от 10-ти секунд до 2-х минут, в зависимости от количества производимых снимков. Встроенный микроскоп автоматически фокусируется на кассете и окрашенные клетки улавливаются чувствительной CCD камерой. Алгоритм анализа цифрового изображения включает подсчёт количества флуоресцентных клеток и расчет их концентрации и размеров.

Рис. 1 Принцип работы ССК.

На практике это выглядит так: перед измерением Вы ставите границы, скажем для молока высшего сорта 300 тыс. колоний клеток и для молока первого сорта 500 тыс. Далее слева от результатов измерений у Вас всегда будет выводиться автоматическая пометка о сортности Вашего молока.

Рис. 2 Программа показывает отредактированное изображение, на котором только маститные клетки.

Флажки показывают следующие состояния здоровья животного:

•  Субклинический мастит
•  Клинический мастит
•  Наличие дрожжевых клеток в пробе молока. Возможен дрожжевой мастит. Необходимо выполнить тест на дрожжевой мастит

Рис. 3 Отмечены все подсчитанные клетки. Маститные клетки помечены красными квадратами, дрожжевые клетки - синими квадратами.

Рис. 4 Реальное изображение результата анализа.

Рис. 5 Экран графиков и заданных параметров границ суб и клинического мастита.

Сущность метода. Его преимущества.

Большинство предприятий в настоящее время применяет вискозиметры для контроля количества соматических клеток. Однако в 2011-2013гг. исследования ГНУ «ВНИИМС РАН» в г. Углич показали, что на итоговые результаты показаний вискозиметров большое влияние оказывает фальсификация молока сырого как химическими веществами, так и путём воздействия температурой:

• добавление в молоко перекиси водорода, мочевины, соды и других веществ, используемых для фальсификации тех или иных показателей молока-сырья, приводит к прямо пропорциональному снижению значений вискозиметра в зависимости от их концентрации
• любое нагревание молока до температур термизации или пастеризации приводит к сбою показаний прибора и вискозиметр показывает значения менее 90 тыс клеток в 1 см³ молока независимо от их истинного содержания.

Эти особенности необходимо учитывать при анализе полученных результатов. Опыт работы многих предприятий свидетельствует о том, что при контроле соматических клеток в молоке с использованием вискозиметра в журналах фиксируется значения менее 90 тыс в 1см³, которые специалисты, принимающие молоко на предприятии, считают нормой и относят данное молоко к высшему сорту. Такие выводы являются очень опасным заблуждением, так как в норме для сборного молока показатель соматических клеток менее 200 тыс в 1см³ у стада на территории РФ не наблюдается.

Таким образом, если стоит задача точно, с относительной погрешностью не более 2...5 %, определить количество соматических клеток, то остаётся два метода:

• прямой подсчёт с использованием микроскопа
• «Флуоресцентный» по сути это тот же микроскопический метод, поскольку также применяется краситель и автоматический микроскоп, результаты которого обрабатывает встроенный компьютер по средствам программного обеспечения.

Прямой подсчёт с использованием микроскопа сопряжён с применением опасных материалов, требует специального оснащения оборудованием. Подготовка и профессиональные навыки микробиолога являются основными решающими факторами использования данного метода. А время проведения самого анализа составляет не менее 3...4 часов. Данный метод может быть реализован только в условиях специализированных лабораторий. Метод крайне трудоёмкий, а время проведения одного анализа составляет не менее 3...4 часов.

Однако метод прямого микроскопирования является единственным прямым методом контроля, позволяющим увидеть, идентифицировать и сосчитать соматические клетки в молоке. Поэтому именно он был взят за основу и модифицирован с флуоресцентным методом при разработке анализатора «Эксперт ССК».

Суть в следующем: лизогенный буфер, находящийся на стенках пробирки, разрушает цитоплазматическую мембрану соматической клетки - при этом ядра клеток становятся доступными для действия флуоресцентного красителя. Краситель связывается с двуспиральной ДНК соматических клеток и образует флуоресцентное вещество, позволяющее идентифицировать клетки. Встроенный компьютер даёт изображение клеток, а программное обеспечение подсчитывает их количество.

В отличие от классического микроскопического метода подсчёта соматических клеток, в данном методе имеется целый ряд преимуществ:

• 4-х кратное увеличение при анализе, высокая воспроизводимость результатов,
• возможность проведения анализов, как в стационарных, так и в полевых условиях.
• Низкая себестоимость анализа (от 35 рублей) и короткое время анализа (от 15 секунд).
• Не требуется дополнительная пробоподготовка образцов и специальные навыки для лаборанта: Вы просто берёте набор кассет и краситель, который идёт в комплекте и образцы молока для исследования. Всё!

В настоящее время данный метод реализован массово только в анализаторе Delaval DCC, Швеция. Этот прибор давно используется в России, зарекомендовал себя, как надёжный и простой в обращении прибор для сырого коровьего молока. Один анализ - одна кассета. Стоимость кассеты, в среднем на Российском рынке составляет 2...2,5 евро, что в рублях около 150...170 рублей за 1 анализ. При анализе делается одна фотография.

Стоимость одного анализа «Эксперт ССК» составляет 35 рублей — каждая кассета рассчитана на 4 измерения. Работать он может с различными типами молока: коровье, козье, овечье - как сырое, так и консервированное. При анализе каждый из четырёх сегментов кассеты делится 4...16 фрагментов и на каждом делается фотография. Таким образом обеспечивается высочайшая точность измерений!

Рис. 6 Кассета с образцами молока: четыре отдельных ячейки, каждая может быть исследована по желанию на 25...100 %

Вся полученная информация сохраняется в памяти, может тут же выводиться на печать встроенного принтера, либо передаваться по Wi-fi или Bluetooth.